Bigger and Better Photons: The Road to Great FLIM?Results
原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅
摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術(shù)的現(xiàn)有和未來用戶從FLIM實(shí)驗(yàn)中獲得最佳結(jié)果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測(cè)量壽命的信噪比在優(yōu)先取決于記錄的光子數(shù)量。第二部分重點(diǎn)介紹優(yōu)化光子數(shù)，而不增加施加到樣品中的光應(yīng)力。我們討論了激發(fā)功率、采集時(shí)間、采集效率、數(shù)值孔徑、聚焦精度、對(duì)準(zhǔn)精度和探測(cè)器效率的影響。第三部分將重點(diǎn)介紹光子效率。它考慮了TCSPC計(jì)時(shí)參數(shù)、計(jì)數(shù)背景、像素?cái)?shù)、儀器響應(yīng)函數(shù)的影響，以及多指數(shù)衰減函數(shù)的挑戰(zhàn)。最后一部分專門介紹數(shù)據(jù)分析。本文中的所有結(jié)論均通過在實(shí)際條件下記錄的真實(shí)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行演示。
第三部分：最大化光子效率
如“信噪比”小節(jié)中所述，TCSPC系統(tǒng)能夠達(dá)到SNR = SQRT（N）的理論信噪比。然而，這要求探測(cè)到的每個(gè)熒光光子都會(huì)向結(jié)果貢獻(xiàn)其最大的信息量。這要求正確配置TCSPC計(jì)時(shí)（timing）參數(shù)，避免記錄背景光子，并以足夠高的精度確定光子時(shí)間，這一部分將討論這些要點(diǎn)。
觀測(cè)時(shí)間間隔
觀測(cè)時(shí)間間隔可以對(duì)壽命的信噪比產(chǎn)生影響。圖 16 顯示了一個(gè)示例，采集相同樣品的兩張圖像，采用相同的計(jì)數(shù)速率和相同的采集時(shí)間，激光重復(fù)率為50 MHz。在5 ns的觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi)記錄了左側(cè)圖像，壽命約為2.2 ns，熒光在觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi)不會(huì)完全衰減，見圖16，第二行左。結(jié)果，衰減函數(shù)尾部的光子沒有被記錄下來，數(shù)據(jù)分析過程只能從記錄的部分衰減確定壽命。因此，像素上壽命的分布比理想條件下更寬，參見圖16，左下角。圖 16 中所示的情況非常常見，較短的觀測(cè)時(shí)間間隔非常適用于壽命極短的樣品，然而，它們也可能無(wú)意中被用于較長(zhǎng)的使用壽命，從而獲得欠佳的光子效率。
右側(cè)的圖像是在12 ns的觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi)記錄的，幾乎所有的光子的衰減函數(shù)都被記錄下來，數(shù)據(jù)分析可用整個(gè)衰減函數(shù)來確定壽命，見圖16的第二行右。因此，壽命的分布（圖16，右下角）比左圖窄。
圖16：在5 ns（左）和12 ns（右）的觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi)記錄的圖像。衰減曲線和直方圖顯示在第二行和第三行。
此外，衰減曲線在觀測(cè)時(shí)間間隔中的位置也會(huì)對(duì)光子效率產(chǎn)生影響。圖 17 顯示了一個(gè)示例。對(duì)于左側(cè)圖像，衰減曲線未正確放置在觀測(cè)時(shí)間窗口中，曲線向右移動(dòng)，因此衰減曲線的遠(yuǎn)端不會(huì)被記錄。圖 17（左）中參數(shù)設(shè)置中的錯(cuò)誤可能看起來微不足道且易于糾正 （參考文獻(xiàn)[2]），但在TCSPC FLIM數(shù)據(jù)中經(jīng)常遇到這種情況。
在右側(cè)的圖像中，衰減數(shù)據(jù)被完美地放置在觀測(cè)時(shí)間窗口中，并記錄了整個(gè)衰減曲線。不僅沒有光子的損失，擬合時(shí)還具有更大的時(shí)間間隔，它可以很好地用于確定壽命值。因此，正確居中的衰減數(shù)據(jù)的壽命直方圖明顯變窄，見圖17，底部。標(biāo)準(zhǔn)差 στ 為 80 ps，而左側(cè)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差為 118 ps。這是一個(gè)1.48的比率，正確居中的衰減數(shù)據(jù)更佳。στ 中 1.48 的比率可能聽起來不多，然而，它轉(zhuǎn)化為光子效率是2.18倍。這意味著錯(cuò)誤配置的系統(tǒng)需要2.18倍的光子數(shù)（或2.18倍的采集時(shí)間！），才能達(dá)到與右側(cè)系統(tǒng)相同的壽命精度。
圖17：衰減曲記錄欠佳的影響。在左圖中，衰減曲線被不正確地放置在觀測(cè)時(shí)間窗口中，衰減曲線的遠(yuǎn)端沒有記錄。在右圖中，衰減數(shù)據(jù)完美地放置在觀測(cè)時(shí)間窗口中。記錄整個(gè)衰減曲線。正確居中的衰減數(shù)據(jù)的壽命直方圖明顯更窄。
圖 16 和圖 17 中左右的壽命圖像的比較也顯示了另一個(gè)效果：
左側(cè)圖像中的壽命偏向于較小的值，原因是熒光衰減不是純粹的單指數(shù)。慢衰減分量在衰減曲線的尾部最為突出，而它在丟失的部分?jǐn)?shù)據(jù)中。當(dāng)數(shù)據(jù)分析過程使用單指數(shù)模型擬合數(shù)據(jù)時(shí)，它只能優(yōu)化衰減數(shù)據(jù)記錄部分的擬合。在這一部分中，慢速分量的表示不足，結(jié)果是確定的壽命比實(shí)際時(shí)間短。采用一階矩技術(shù)的情況更糟，由于缺少熒光衰減的尾部，計(jì)算的矩太小，因此從一階矩得出的熒光壽命太小。
激光器重復(fù)頻率
使用ps二極管激光器的FLIM系統(tǒng)可以在不同的激光重頻下工作，參考文獻(xiàn)[5，6，7]。標(biāo)準(zhǔn)重頻為 20 MHz、50 MHz 和 80 MHz，其他重頻也可按需定制。使用Ti：Sa激光器的多光子FLIM系統(tǒng)以80 MHz的頻率運(yùn)行，而采用飛秒光纖激光器的系統(tǒng)通常使用40 MHz，參考文獻(xiàn) [14]。哪種重頻最好？5 ns的熒光壽命是否仍能以 80 MHz 的重頻準(zhǔn)確測(cè)定？我是否應(yīng)該總是使用80 MHz，因?yàn)樗谐渥愕募ぐl(fā)功率？
圖18顯示了染料溶液掃描中選定點(diǎn)的衰減曲線，熒光壽命為5.6 ns。上部曲線以50 MHz獲得，下部曲線以80 MHz重頻獲得，光子數(shù)約為20,000，在兩條曲線中大致相同，但這兩條曲線都包含大量來自上一個(gè)激發(fā)脈沖激發(fā)出的光子的“不完全衰減”。當(dāng)然，在80 MHz的記錄中，不完全衰減的量更高，因?yàn)闊晒馑p的時(shí)間更短。顯而易見，衰減不完全的數(shù)據(jù)不能用一階矩技術(shù)來分析。它們可以使用SPCImage的“不完全衰減”模型進(jìn)行處理，以這種方式處理圖像會(huì)產(chǎn)生圖18中右圖所示的壽命分布。
圖18：染料溶液的熒光衰減函數(shù)，5.6 ns熒光壽命。頂部：激光重復(fù)率 50 MHz。底部：激光重復(fù)率 80 MHz。左側(cè)：衰減曲線。右側(cè)：像素上壽命的直方圖。
結(jié)果是令人意外的：盡管50-MHz曲線看起來更加“分析友好”，但直方圖實(shí)際上是相同的。為什么？原因是5.6 ns衰減和另一個(gè)5.6 ns衰減的總和偏移了一個(gè)周期，仍然是5.6 ns衰減。因此，擬合程序以合理的標(biāo)準(zhǔn)偏差提供正確的壽命值。標(biāo)準(zhǔn)偏差大于20，000光子的理想值，但對(duì)于兩個(gè)記錄都是相同的。與理想記錄相比的損失來自記錄時(shí)間間隔不覆蓋整個(gè)衰減的事實(shí)，而不是來自存在不完全衰減的事實(shí)。圖 19 支持這一點(diǎn)，它顯示50 MHz的記錄，但在20 ns的觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi)，壽命分布明顯更窄。
圖19：5.6 ns的熒光衰減，以50 MHz的重頻，記錄在20 ns的觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi)。
所以結(jié)論是：如果可能的話，使用盡可能覆蓋熒光衰減的記錄時(shí)間窗口。如果因?yàn)榧す饷}沖周期太短而無(wú)法這樣做，不要擔(dān)心，數(shù)據(jù)分析將處理不完整的衰減，并提取最佳的壽命信息。
計(jì)數(shù)背景
計(jì)數(shù)背景不僅是FLIM數(shù)據(jù)中最常見的缺陷，也是最具破壞性的缺陷。幸運(yùn)的是，這也是最容易避免的，在大多數(shù)情況下，背景只是來自日光的影響。最脆弱的是采用非解掃探測(cè)（NDD）的多光子系統(tǒng)，這些系統(tǒng)沒有針孔可以阻擋來自激發(fā)點(diǎn)外部的光，它們直接探測(cè)樣品散射出來的光子，從樣品表面的大面積區(qū)域收集光，這樣做的副作用是它們對(duì)環(huán)境光也很敏感。因此，必須使系統(tǒng)遠(yuǎn)離日光。
圖20顯示了如果衰減數(shù)據(jù)被背景計(jì)數(shù)覆蓋會(huì)發(fā)生什么情況。熒光光子（a）的平均到達(dá)時(shí)間<t> = τ，時(shí)序噪聲為σt = τ。我們可以單獨(dú)建立熒光光子的光子分布，它將代表真正的熒光衰減曲線（a，右），以στ = τ / SQRT（N）的標(biāo)準(zhǔn)偏差提供熒光壽命，即光子效率為1。背景光子（b）在整個(gè)觀測(cè)時(shí)間窗口（T）上均勻分布，它們的平均到達(dá)時(shí)間為T/2，時(shí)序噪聲為σtbkg=0.28 T（見圖24）。
記錄過程在熒光和背景光子之間沒有區(qū)別，因此，探測(cè)到的信號(hào)（c）是熒光衰減和背景的總和。這會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)不利影響：首先，平均到達(dá)時(shí)間不再是熒光衰減時(shí)間τ，相反，它是壽命τ和背景光子平均T/2的光子數(shù)加權(quán)平均值，因此，數(shù)據(jù)不能通過一階矩或基于矩的任何其他技術(shù)進(jìn)行分析。
其次，有效定時(shí)噪聲是熒光光子的定時(shí)噪聲σt = τ和背景的定時(shí)噪聲σtbkd = 0.28 T的加權(quán)和。在大多數(shù)情況下，0.28 T 大于 τ，因此，它對(duì)凈標(biāo)準(zhǔn)差（測(cè)量壽命的 στmeas）有很大的影響。精確計(jì)算στmeas以及光子效率是困難的，并且提供的結(jié)果不容易解釋。上述討論表明，計(jì)數(shù)背景對(duì)探測(cè)到的熒光壽命有很大影響。
圖20：計(jì)數(shù)背景對(duì)光子時(shí)間的影響
一個(gè)實(shí)際示例如圖 21 所示，來自同一樣品的FLIM圖像以帶背景（左）和不帶背景（右）記錄。在左圖中，每個(gè)像素中的背景約為900計(jì)數(shù)（所有時(shí)間通道的總和），在右圖中接近于零，最亮像素中的熒光光子數(shù)量約為4000。因此，背景明顯損害了圖像的對(duì)比度，參見圖21，左圖。然而，對(duì)比度的損失并不是那么糟糕，但圖像模糊了。右圖沒有背景，因此提供了最大的對(duì)比度。
所選點(diǎn)中的衰減曲線顯示在第二行中，左圖的衰減曲線包含背景計(jì)數(shù)，右圖的衰減曲線不包含背景計(jì)數(shù)。背景似乎很溫和，看起來不像是一個(gè)真正的問題，然而，對(duì)壽命準(zhǔn)確性的影響是巨大的。這可以在圖21的第三行中看到，它顯示了每個(gè)記錄的phasor?plot圖和按一階矩計(jì)算的壽命直方圖。可以很容易地看出，左側(cè)數(shù)據(jù)組的直方圖和phasor?plot圖不僅完全偏移，而且極度展寬。原因不僅在于背景為光子數(shù)據(jù)增加了時(shí)序噪聲，還在于背景為矩增加了偏移。由于熒光信號(hào)和背景信號(hào)的比值隨像素的亮度而變化，因此壽命值被極度模糊。
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圖21：計(jì)數(shù)背景對(duì)FLIM精度的影響。左：帶背景計(jì)數(shù)的 FLIM 數(shù)據(jù)。右：無(wú)背景記錄。上行：圖像。第二行：所選點(diǎn)中的衰減數(shù)據(jù)。第三行：M1 分析的Phasor plots圖和壽命直方圖。最下行：采用 MLE 分析的壽命直方圖。
圖21的底行顯示了采用MLE分析獲得的壽命直方圖，就壽命移位而言，擬合過程比矩分析做得更好。壽命大約是170 ps，直方圖比右邊的無(wú)背景記錄寬兩倍，壽命標(biāo)準(zhǔn)偏差的兩倍轉(zhuǎn)化為光子效率是相差四倍！
時(shí)間通道數(shù)
與普遍的觀點(diǎn)相反，衰減曲線中的時(shí)間通道數(shù)對(duì)信噪比沒有直接影響。它沒有出現(xiàn)在一階矩分析推導(dǎo)的SNR方程（“信噪比”小節(jié)）中，并且擬合例程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并不關(guān)心FLIM數(shù)據(jù)在兩倍的時(shí)間通道中是否只有一半的光子數(shù)量，反之亦然。只有衰減曲線中的光子總數(shù)才重要，圖22給出了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。它顯示了一個(gè)用Alexa 488染色的樣品，在所使用的探測(cè)波長(zhǎng)下，整個(gè)掃描區(qū)域的壽命幾乎是均勻的。第一行中的數(shù)據(jù)用64個(gè)時(shí)間通道記錄，第二行的數(shù)據(jù)用1024個(gè)時(shí)間通道記錄，圖像中的光子總數(shù)幾乎相同。正如預(yù)期的那樣，壽命直方圖（第一行和第二行，右）幾乎相同。
圖22：使用不同數(shù)量的時(shí)間通道，相同的光子總數(shù)進(jìn)行記錄。上排：64 個(gè)時(shí)間通道。下排：1024個(gè)時(shí)間通道。從左到右：圖像，光標(biāo)位置的衰減曲線，單指數(shù)擬合，像素上壽命直方圖。與普遍的觀點(diǎn)相反，在64通道記錄中，每個(gè)時(shí)間通道的光子數(shù)量越多，并沒表現(xiàn)出更高的壽命精度。
壽命的SNR與時(shí)間通道數(shù)無(wú)關(guān)，這并不意味著可以使用數(shù)量任意小的時(shí)間通道和任意大的時(shí)間通道寬度。在兩個(gè)或四個(gè)時(shí)間通道中進(jìn)行探測(cè)會(huì)大大降低光子效率，參考文獻(xiàn)[1，10，16]。當(dāng)時(shí)間通道寬度與IRF寬度的數(shù)量級(jí)相同時(shí)，SNR已經(jīng)開始下降。這種情況下，不清楚IRF在第一個(gè)通道中的位置，以及熒光脈沖的上升開始的位置。這增加了壽命計(jì)算的不確定性。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，IRF和最快的衰減分量都應(yīng)使用不少于5至10個(gè)時(shí)間通道進(jìn)行采樣。這意味著，對(duì)于HPM-100-40探測(cè)器（IRF寬度120 ps），探測(cè)低至100 ps的快速衰減分量，時(shí)間通道寬度應(yīng)約為10 ps。對(duì)于 10 ns 的觀測(cè)時(shí)間間隔，時(shí)間通道數(shù)應(yīng)為 1024。對(duì)于 HPM-100-06（IRF 寬度<20 ps），將時(shí)間通道數(shù)增加到 4096（即將時(shí)間通道寬度減小到3 ps）是合理的，如果要探測(cè)超快衰減分量，采用更窄的時(shí)間通道更佳。
IRF——儀器響應(yīng)函數(shù)的影響
如果 FLIM 系統(tǒng)的 IRF 具有非零寬度，會(huì)發(fā)生什么情況？IRF的影響可以通過觀察光子到達(dá)時(shí)間來估計(jì)。讓我們假設(shè)我們已經(jīng)記錄或以其他方式確定了FLIM系統(tǒng)的IRF，然后，我們可以通過平均IRF測(cè)量的光子時(shí)間來定義IRF的“質(zhì)心<tirf>。如圖6所示，熒光衰減時(shí)間τ是通過簡(jiǎn)單地從平均光子時(shí)間<t>中減去<tirf>而獲得的，參見圖23，左圖。
圖 23：IRF 寬度不為零的系統(tǒng)中壽命測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。左圖：壽命是光子的平均到達(dá)時(shí)間 t 減去 IRF 質(zhì)心的時(shí)間，<tirf>。右圖：測(cè)量壽命的標(biāo)準(zhǔn)差 τmeas 包含 IRF σirf 的貢獻(xiàn)。
以這種方式獲得的壽命標(biāo)準(zhǔn)偏差是多少？可以假設(shè)標(biāo)準(zhǔn)差仍然是τ / SQRT（N）：IRF的質(zhì)心是準(zhǔn)確的，減去它不會(huì)改變t的標(biāo)準(zhǔn)差，但這是不可能的，因?yàn)楣庾訒r(shí)間本身包含來自IRF的不確定性，每個(gè)熒光光子定時(shí)參考在IRF中都是不同時(shí)間。另外，它可能在激光脈沖的不同時(shí)間被激發(fā)，或者它花了不同的時(shí)間通過探測(cè)器，這增加了光子時(shí)間t的不確定性，并增加了IRF σirf對(duì)理想光子時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差σt = τ的貢獻(xiàn)。
因此，測(cè)量光子乘以σtmeas的標(biāo)準(zhǔn)差大于τ，測(cè)量壽命的標(biāo)準(zhǔn)偏差στmeas大于τ / SQRT（N），可以通過下式來進(jìn)行估算：
στmeas = SQRT (τ2 + σ2irf) / SQRT (N)
或
σirf也被稱為“計(jì)時(shí)抖動(dòng)的RMS值”或 （有點(diǎn)誤導(dǎo)地）“IRF寬度的RMS值”。對(duì)于在實(shí)踐中遇到的IRF形狀，它大約是IRF半高寬（FWHM）最大值的0.43到0.87。圖 24 給出了幾種典型 IRF 形狀的 RMS 與 FWHM 值。對(duì)于高斯IRF，計(jì)時(shí)抖動(dòng)的RMS值為0.43 FWHM。對(duì)于非對(duì)稱函數(shù)，這個(gè)值會(huì)更大。具有慢尾或帶有凸起的IRF會(huì)給衰減數(shù)據(jù)增加更多的時(shí)序噪聲，如果可能的話，應(yīng)該避免使用。請(qǐng)注意，尾部和凸起也可能源于過高功率下工作的皮秒二極管激光器。不利的IRF形狀造成的精度損失實(shí)際上可能超過光子數(shù)量增加帶來的增益。
圖 24：一些典型 IRF 形狀的 RMS 值。從左到右：矩形、高斯、x?e-x、有凸起的x?e-x、指數(shù)函數(shù) e-x 。函數(shù)歸一化為相同的FWHM，RMS值以FWHM的倍數(shù)給出。
從這個(gè)結(jié)果中可以得出兩個(gè)結(jié)論。第一個(gè)是，毫不奇怪，SNR仍然與N的平方根一起縮放。第二個(gè)是，只有當(dāng)IRF寬度的RMS大于熒光壽命的約50%至100%時(shí)，SNR才會(huì)大幅下降。隨著IRF寬度的增加，壽命精度的下降緩慢。這導(dǎo)致了一種誤解，即FLIM系統(tǒng)的IRF寬度并不重要：典型熒光團(tuán)的熒光壽命在幾納秒的范圍內(nèi)，因此，如果 IRF 是完全已知的，則 500 ps 到 1 ns（RMS） 的 IRF 寬度應(yīng)該就足夠了。然而，這與任何實(shí)際經(jīng)驗(yàn)相矛盾，錯(cuò)誤出在哪里？
FLIM中的熒光衰減函數(shù)不是單指數(shù)的，不僅如此，所需的信息通常是在衰減函數(shù)的組成中，而不是在凈“壽命”中。在這種情況下，IRF必須比最快的衰減分量快。FRET測(cè)量和自發(fā)熒光測(cè)量中的主要衰減成分分別低至約300 ps和100 ps，參考文獻(xiàn)[2]，HPM-100-40 探測(cè)器非常適合這些應(yīng)用。在蘑菇孢子，參考文獻(xiàn)[12]，人類頭發(fā)和哺乳動(dòng)物皮膚病變中，會(huì)遇到低至10 ps范圍的壽命。這些測(cè)量需要更快的探測(cè)器。示例將顯示在“多指數(shù)衰減函數(shù)”一節(jié)中。
多指數(shù)衰減函數(shù)
當(dāng)FLIM僅用作激光掃描顯微鏡中的比對(duì)技術(shù)時(shí)，熒光衰減的單指數(shù)近似值及其表觀壽命的測(cè)量可能就足夠了。然而，FLIM的真正應(yīng)用是分子成像。熒光團(tuán) – 無(wú)論是內(nèi)源性還是外源性 – 根據(jù)其分子環(huán)境改變其熒光壽命。這可能與蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)的相互作用，細(xì)胞或組織代謝狀態(tài)的影響，或參與細(xì)胞功能的離子濃度相結(jié)合。在這些應(yīng)用中，任務(wù)不是區(qū)分不同的熒光團(tuán)，而是區(qū)分不同分子環(huán)境中相同熒光團(tuán)的組分，并通過其相對(duì)濃度量化它們，參考文獻(xiàn)[1，4，15]。在大多數(shù)情況下，這需要記錄多指數(shù)衰減函數(shù)，并將它們分成不同的衰減分量。因此，多指數(shù)衰減記錄和多指數(shù)衰減分析是生物系統(tǒng)的FLIM標(biāo)準(zhǔn)配置。圖 25 和圖 26 顯示了幾個(gè)示例。圖30、圖31和圖38顯示了多指數(shù)FLIM測(cè)量的更多示例。
圖25：頂部：人體視網(wǎng)膜的FLIM圖像，在體記錄。快速、中衰減和慢衰減分量的強(qiáng)度貢獻(xiàn)。底部：圖像選定點(diǎn)的衰減曲線。數(shù)據(jù)由耶拿大學(xué)的Dietrich Schweitzer和Martin Hammer提供。
圖26：通過FLIM對(duì)NADH（左）和FAD（右）進(jìn)行代謝成像。雙指數(shù)衰減的振幅加權(quán)壽命（tm）、和快速衰減分量振幅a1的圖像。底部：NADH和FAD圖像的選定點(diǎn)中的衰減函數(shù)。
從多指數(shù)衰減分析中提取單個(gè)衰減分量比單指數(shù)擬合或一階矩分析需要更多的光子，參考文獻(xiàn)[17]。因此，探測(cè)效率和光子效率是關(guān)鍵參數(shù)。時(shí)間分辨率也很重要 – 對(duì)IRF寬度的要求是由最快衰減分量的壽命決定的，而不是由凈衰減函數(shù)的表觀壽命決定的。
同樣重要的是衰減函數(shù)的形狀，它們與單指數(shù)衰減的差異越大越好。具有幾乎相同壽命的衰減分量很難或不可能分裂，參考文獻(xiàn)[17]，低振幅的衰減分量也很難提取。圖 27 顯示了三個(gè)示例。左圖所示的函數(shù)在 2.4 ns 的背景中包含 445 ns 的 82 %。這很容易解決。中間的函數(shù)比較困難。快速分量的幅度僅為24%，壽命值接近900 ps，而慢速分量的幅度為2.5 ns。凈衰減函數(shù)比左邊的函數(shù)更接近單指數(shù)。右側(cè)的衰減輪廓在視覺上與單指數(shù)衰減無(wú)法區(qū)分。它包含35%的3 ns和65%的4.5 ns，使用FLIM中通常可用的光子數(shù)量，無(wú)法逐個(gè)像素地解析。
圖 27：雙指數(shù)衰減函數(shù)。左側(cè)的函數(shù)易于解析，中間的函數(shù)難以解析，右側(cè)的函數(shù)在FLIM數(shù)據(jù)中幾乎不可能解析。
圖27右所示的情況，如果可能的話，應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)計(jì)劃中避免。一個(gè)例子是FRET實(shí)驗(yàn)：具有大供體 – 受體重疊的FRET對(duì)，和具有短供體 – 受體距離和大比例供體相互作用的FRET結(jié)構(gòu)，以大振幅和短壽命提供供體衰減函數(shù)的快速分量。這使得衰減輪廓更容易分辨，從而分離相互作用和非相互作用的供體部分。在某些情況下，如果信號(hào)利用光譜進(jìn)一步分離，結(jié)果可以得到極大的改善。衰減分量的數(shù)量得以減少，分析變得更加容易。光譜分離可以在激發(fā)端和探測(cè)端獲得。一個(gè)例子是NADH / FAD FLIM的代謝成像。當(dāng)兩個(gè)熒光團(tuán)以相同的波長(zhǎng)激發(fā)（正如經(jīng)常嘗試的那樣）并且僅通過不同的發(fā)射濾光片觀察到時(shí)，這種情況幾乎是無(wú)望的。然而，通過在正確的波長(zhǎng)間隔內(nèi)進(jìn)行多路復(fù)用激發(fā)和探測(cè)，信號(hào)可以很好地分離，參考文獻(xiàn)[15]。因此，在樣品設(shè)計(jì)和FLIM配置方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)規(guī)劃對(duì)結(jié)果的質(zhì)量有很大的影響。
圖28和圖29給出了多指數(shù)衰減測(cè)量的示例。圖28顯示了NADH溶液的FLIM數(shù)據(jù)。使用溶液獲得在整個(gè)掃描區(qū)域均勻的壽命分布。然后，像素上的參數(shù)直方圖由光子噪聲決定，而不是由掃描區(qū)域的壽命變化決定。在785 nm處用雙光子激發(fā)記錄數(shù)據(jù)，用512 x 512像素，1024個(gè)時(shí)間通道掃描圖像。從上到下，圖28顯示了使用H7422-40 PMT探測(cè)器以及HPM-100-40和HPM-100-06混合探測(cè)器記錄的數(shù)據(jù)。IRF 寬度分別為 250 ps、110 ps 和 18 ps。從左到右，該圖顯示了任意選定點(diǎn)的衰減曲線、快速分量 t1 的壽命直方圖、第二快分量 t2 的直方圖和慢分量 t3 的直方圖。
可以清楚地看到，隨著IRF寬度的減小，壽命直方圖變得更窄。有趣的是，這不僅適用于快速分量，也適用于中慢分量。使用 HPM-100-06 獲得最佳結(jié)果，即 IRF 寬度為 18 ps。使用如此快速的IRF記錄的衰減數(shù)據(jù)幾乎不受IRF引起的計(jì)時(shí)抖動(dòng)的影響。HPM-100-06的t1、t2 和 t3 的直方圖比 H7422 窄 1.4 倍，這意味著它的光子效率高出2倍。
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圖28：NADH溶液，用不同探測(cè)器記錄的數(shù)據(jù)。上排：H7422-40探測(cè)器，IRF寬度250 ps。第二排：HPM-100-40，IRF 寬度 110 ps。下排：HPM-100-06，IRF 寬度 18 ps。從左到右：任意選定點(diǎn)的衰減曲線，快速分量的直方圖，t1，第二快分量的直方圖，t2，慢分量的直方圖，t3。雙光子激發(fā)，非解掃描探測(cè)，圖像512×512像素，1024個(gè)時(shí)間通道，約5000個(gè)光子在合并區(qū)域里。
圖29給出了對(duì)壽命低于25ps的超快衰減分量探測(cè)的示例。這種快速分量很常見，我們經(jīng)常在人類的頭發(fā)，蘑菇孢子和哺乳動(dòng)物皮膚的痣中發(fā)現(xiàn)它們。在黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的熒光衰減中也存在一種快速分量，F(xiàn)AD是一種存在于每個(gè)細(xì)胞中的天然熒光團(tuán)。FAD很重要，因?yàn)樗臒晒馑p函數(shù)包含有關(guān)細(xì)胞代謝狀態(tài)的信息。
圖29顯示了FAD溶液的FLIM圖像。從左到右，該圖顯示了快速衰減分量 t1、三重指數(shù)擬合的衰減曲線和 t1 直方圖的圖像。上行的數(shù)據(jù)用HPM-100-40探測(cè)器記錄，下排的數(shù)據(jù)用HPM-100-06記錄。從視覺上看，HPM-100-40（IRF 110 ps FWHM）記錄的衰減曲線沒有顯示出快速分量的痕跡。但是，仔細(xì)的數(shù)據(jù)分析會(huì)提取一個(gè)使用壽命約為20 ps的分量。除非明確搜索，否則不易發(fā)現(xiàn)。整個(gè)圖像上 t1 值的直方圖顯示在右側(cè)。
用HPM-100-06（IRF寬度18 ps FWHM）記錄的數(shù)據(jù)。衰減曲線令人信服地表明，快速分量確實(shí)存在。在圖像的選定位置進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，最快的分量的壽命為16.5 ps（其他兩個(gè)分量分別為2.2 ns和3.2 ns）。直方圖顯示最常見的 t1 值約為 16 ps。
正如對(duì)快速IRF所預(yù)期的那樣，直方圖比HPM-100-40的數(shù)據(jù)窄了近2倍。
圖29：FAD溶液的熒光。從左到右：快速衰減分量t1的圖像，三重指數(shù)分析的衰減曲線，t1的直方圖。上排：用 HPM-100-40 探測(cè)器記錄，IRF 寬度 110 ps FWHM。下排：使用 HPM-100-06 探測(cè)，IRF 寬度 18 ps FWHM。
IRF 寬度 vs 探測(cè)器效率
應(yīng)該注意的是，探測(cè)器的IRF寬度與探測(cè)效率之間存在潛在的取舍。快速探測(cè)器具有傳統(tǒng)的雙堿光陰極，因此，它們的靈敏度比GaAsP探測(cè)器低約4倍，但沒法知道更快的IRF和更高的靈敏度誰(shuí)更重要。當(dāng)然，為了解析超快衰減分量，沒有辦法繞過快速IRF，無(wú)論您是實(shí)際看到快速分量還是必須通過反卷積將其從數(shù)據(jù)中擠出。我們還發(fā)現(xiàn)，使用低于20ps的IRF對(duì)NADH和FAD數(shù)據(jù)的雙指數(shù)和三指數(shù)衰減分析更可靠，參考文獻(xiàn)[2，13]，這也可以在圖28的底部看到。在實(shí)踐中，探測(cè)器的選擇取決于樣品的光穩(wěn)定性。如果樣品在四倍的激發(fā)功率下或四倍的采集時(shí)間內(nèi)依然保持穩(wěn)定，則選擇快速IRF的探測(cè)器。反之，則必須使用GaAsP探測(cè)器。
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