Bigger and Better Photons: The Road to Great FLIM?Results
原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅
摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術(shù)的現(xiàn)有和未來(lái)用戶從FLIM實(shí)驗(yàn)中獲得最佳結(jié)果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測(cè)量壽命的信噪比在優(yōu)先取決于記錄的光子數(shù)量。第二部分重點(diǎn)介紹優(yōu)化光子數(shù)，而不增加施加到樣品中的光應(yīng)力。我們討論了激發(fā)功率、采集時(shí)間、采集效率、數(shù)值孔徑、聚焦精度、對(duì)準(zhǔn)精度和探測(cè)器效率的影響。第三部分將重點(diǎn)介紹光子效率。它考慮了TCSPC計(jì)時(shí)參數(shù)、計(jì)數(shù)背景、像素?cái)?shù)、儀器響應(yīng)函數(shù)的影響，以及多指數(shù)衰減函數(shù)的挑戰(zhàn)。最后一部分專門介紹數(shù)據(jù)分析。本文中的所有結(jié)論均通過(guò)在實(shí)際條件下記錄的真實(shí)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行演示。
第四部分：數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)分析無(wú)法彌補(bǔ)低質(zhì)量的FLIM數(shù)據(jù)，但可以從樣本和實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)后采集的數(shù)據(jù)里提取大量信息，詳情參考文獻(xiàn)[3]。以下部分僅介紹幾個(gè)要點(diǎn)，并在典型的 FLIM 數(shù)據(jù)上進(jìn)行了演示。
選擇什么模型擬合?
關(guān)于FLIM數(shù)據(jù)分析的第一個(gè)問(wèn)題通常是：我應(yīng)該使用哪種模型？需要多少個(gè)衰減分量才能擬合結(jié)果？
答案并不取決于樣品實(shí)際具有的衰減分量的數(shù)量，而是取決于你希望從樣品中找出什么信息。因此，除了你自己，沒(méi)有人能回答這個(gè)問(wèn)題。你對(duì)特定生物系統(tǒng)中正在發(fā)生的事情有一個(gè)假設(shè)，你設(shè)計(jì)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)和一個(gè)樣本來(lái)確認(rèn)或排除假設(shè)。只有你才能知道樣品中預(yù)期會(huì)發(fā)生什么，只有你才能知道衰減函數(shù)中預(yù)計(jì)會(huì)有多少分量。因此，你應(yīng)該選擇不同的，并具有相應(yīng)衰減分量數(shù)的模型（并且只有這個(gè)模型）來(lái)擬合數(shù)據(jù)。
比如，你正在做一個(gè)蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)，采用FRET作為蛋白質(zhì)相互作用的指示，用供體標(biāo)記一種蛋白質(zhì)，用受體標(biāo)記另一種蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)相互作用的地方應(yīng)該發(fā)生FRET，F(xiàn)RET縮短了供體的熒光壽命。因此，您可以在供體發(fā)射波長(zhǎng)處獲取FLIM數(shù)據(jù)。在 SPCImage 中加載數(shù)據(jù)并使用單指數(shù)模型運(yùn)行分析。細(xì)胞膜中的熒光壽命最短處 – 正是您預(yù)計(jì)的蛋白質(zhì)相互作用的地方（圖30，左）。
您可以檢查圖像的幾個(gè)特征點(diǎn)中的衰減函數(shù)。在壽命較短的地方，單指數(shù)模型不能正確擬合衰減函數(shù)，但雙指數(shù)模型適合（圖 30，左二）。這是合理的：首先，并非所有供體分子都對(duì)受體具有正確的取向（FRET發(fā)生條件之一）。其次，蛋白質(zhì)相互作用是一種化學(xué)平衡，應(yīng)該有相互作用和非相互作用的供體的混合。這些組分具有不同的壽命，因此衰減曲線應(yīng)該是雙指數(shù)的。
現(xiàn)在，您可以使用雙指數(shù)模型運(yùn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)于顯示，請(qǐng)選擇振幅加權(quán)平均壽命 tm，這是經(jīng)典 FRET 效率的表示，如圖 30 右二所示。接下來(lái)，選擇快衰減分量和慢衰減分量的振幅之比，該比值表示相互作用和非相互作用的供體的相對(duì)數(shù)量，它在細(xì)胞膜中蛋白質(zhì)相互作用的地方最高，見(jiàn)圖30，右圖。結(jié)果表明，雙指數(shù)模型適合擬合數(shù)據(jù)，并且表明初始假設(shè)可能是正確的。
圖 30：FLIM-FRET 測(cè)量結(jié)果。從左到右：?jiǎn)沃笖?shù)壽命圖像，光標(biāo)位置衰減曲線，雙指數(shù)模型的振幅加權(quán)壽命圖像（顯示經(jīng)典FRET強(qiáng)度），振幅比圖像，顯示相互作用蛋白質(zhì)的相對(duì)比值）。
選擇要顯示的參數(shù)
SPCImage提供了幾個(gè)選項(xiàng)來(lái)顯示衰減函數(shù)的參數(shù)：經(jīng)典的單指數(shù)壽命，衰減分量的壽命，振幅加權(quán)平均值和強(qiáng)度加權(quán)平均的分量壽命值，以及衰減分量中包含的相對(duì)強(qiáng)度，參考文獻(xiàn)[3]，SPCImage 還顯示這些參數(shù)的比值。如果可能，應(yīng)選擇最清楚地顯示感興趣效果的參數(shù)組合。例如，在 FRET測(cè)量中，雙指數(shù)擬合的振幅加權(quán)壽命表示經(jīng)典的 FRET效率，以及振幅之比 a1/a2（相互作用供體的相對(duì)比值）。示例如上圖 30 所示。
代謝成像的示例如圖31所示。左圖顯示了自由和束縛NADH的衰減分量的振幅比，該參數(shù)表征細(xì)胞的代謝狀態(tài)。分量壽命（t1 和 t2）的圖像顯示在中間和右側(cè)，壽命的不均勻性表明NADH處在單個(gè)線粒體中的不同的分子環(huán)境。
圖31：從左到右：活細(xì)胞的NADH圖像。振幅比，a1/a2（未束縛/束縛比）以及快衰減分量（t1，未束縛的NADH）和慢衰減分量（t2，束縛的NADH）的圖像。FLIM數(shù)據(jù)格式 512×512像素。底部：選定點(diǎn)的衰減曲線，1024個(gè)時(shí)間通道，時(shí)間通道寬度 10ps。
Binning——“像素合并”
FLIM用戶通常不贊成將壽命數(shù)據(jù)合并，認(rèn)為這是一種不科學(xué)地調(diào)整測(cè)量結(jié)果的方式。然而，正確的合并是任何準(zhǔn)確可靠的FLIM數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵。光學(xué)系統(tǒng)成像時(shí)，空間分辨率受到衍射極限的限制，單點(diǎn)光的衍射圖稱為Airy圓盤或（在顯微鏡下）點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。為了達(dá)到衍射極限分辨率，數(shù)據(jù)不得通過(guò)像素化來(lái)模糊。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的中心圓盤應(yīng)約按 5 x 5像素采樣，當(dāng)然，此區(qū)域內(nèi)像素中的壽命信息非常相似。因此，將這些像素的時(shí)間數(shù)據(jù)組合用于FLIM分析是合適的，請(qǐng)參見(jiàn)圖32左。結(jié)果是光子數(shù)大幅增加，壽命精度相應(yīng)提高。請(qǐng)注意，合并5 x 5像素區(qū)域會(huì)使凈光子數(shù)增加25倍！
在 SPCImage 軟件中，通過(guò)組合定義合并區(qū)域的數(shù)據(jù)并將凈衰減曲線分配給中心像素來(lái)執(zhí)行合并。因此，圖像中的有效像素?cái)?shù)不會(huì)改變，該程序還符合優(yōu)質(zhì)圖像的美學(xué)角度。從視覺(jué)上看，圖像在開(kāi)始看起來(lái)很丑陋之前，包含大量的強(qiáng)度噪聲。然而，在FLIM應(yīng)用中，壽命數(shù)據(jù)中相同數(shù)量的噪聲將使數(shù)據(jù)無(wú)用。因此，在具有一定強(qiáng)度噪聲的大量像素下顯示圖像是有意義的，但壽命平均在更大的區(qū)域內(nèi)，并且相應(yīng)地增加了信噪比。
SPCImage 中的像素合并原理如圖 32 右所示。
圖 32：左：對(duì)強(qiáng)度圖像中的 Airy 圓盤進(jìn)行過(guò)采樣，以及合并像素用于壽命計(jì)算。右：用于壽命計(jì)算的像素重疊合并。
SPCImage 軟件中合并參數(shù)（binning parameter） n 的含義如圖 33 所示。請(qǐng)注意，合并系數(shù)2對(duì)應(yīng) 5 x 5 像素區(qū)域，即大致對(duì)應(yīng)于正確采樣圖像中點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的面積。無(wú)意中，圖像通常使用較高的過(guò)采樣率拍攝，尤其是在使用掃描儀的高變焦系數(shù)時(shí)。因此，SPCImage提供合并系數(shù)最多為10像素合并，對(duì)應(yīng) 20 x 20 的像素區(qū)域。
圖 33：合并系數(shù)n的功能，‘Square’（左）和‘Circular’ （右）合并。
圖 34 給出了像素合并（binning）效果的演示，用512 x 512像素掃描BPEA樣品，將衰減曲線記錄到1024個(gè)時(shí)間通道中。未做像素合并的數(shù)據(jù)如圖 34 的頂行所示。左側(cè)顯示了（單指數(shù)）壽命圖像。在不進(jìn)行像素合并的情況下，每個(gè)像素的光子數(shù)量極低，請(qǐng)參閱中圖。因此，壽命圖像看起來(lái)很嘈雜，衰減時(shí)間散布在各處，請(qǐng)參閱右側(cè)的壽命直方圖。圖 34 的底行顯示了使用像素合并的數(shù)據(jù)。采用圓形合并，合并系數(shù)為 2，對(duì)應(yīng)21 個(gè)像素區(qū)域的合并。壽命圖像質(zhì)量?jī)?yōu)異，凈衰減函數(shù)具有足夠的光子以進(jìn)行合理擬合，并且壽命直方圖具有合理的寬度。從圖像中可以看出，顏色不會(huì)模糊，即像素合并不會(huì)對(duì)整個(gè)壽命的空間分辨率造成明顯的損失。
圖 34：像素合并（binning）在壽命分析中的影響。512 x 512 像素，1024 個(gè)時(shí)間通道。頂部：無(wú)合并。底部：合并系數(shù) 2，圓形合并，21個(gè)像素的衰減曲線的總和用于中心像素的分析。
合并系數(shù)為2（將21個(gè)像素的衰減曲線合并到中心像素中，見(jiàn)圖33），合并后的數(shù)據(jù)甚至足以進(jìn)行雙指數(shù)衰減分析。結(jié)果如圖 35 所示，頂行從左到右顯示了快衰減分量和慢衰減分量的壽命圖像，以及兩個(gè)分量振幅之比的圖像。這三幅圖像在空間分辨率和壽命分辨率方面都具有良好的質(zhì)量。底行顯示參數(shù)直方圖，它們表明，分量壽命和振幅比是在良好的信噪比下獲得的（請(qǐng)注意不同的參數(shù)范圍）。
圖 35：與圖 34 中底行數(shù)據(jù)相同，雙指數(shù)衰減分析。從左到右：快分量的壽命圖像t1，慢分量的壽命圖像t2，振幅比圖像a1/a2。請(qǐng)注意不同的參數(shù)范圍。
圖36顯示了合并對(duì)壽命信息的空間分辨率的影響。該圖顯示了圖34和圖35中大細(xì)胞中心70 x 70像素區(qū)域的數(shù)據(jù)。正如預(yù)期的那樣，在合并系數(shù)≤2時(shí)，壽命對(duì)比度基本保持不變，請(qǐng)參考中心的花狀結(jié)構(gòu)。對(duì)于 4 和 6（右2和右1）的合并系數(shù)，壽命對(duì)比度開(kāi)始降低。來(lái)自相鄰像素的太多衰減數(shù)據(jù)被混合到凈衰減函數(shù)中，因此，中間的結(jié)構(gòu)越來(lái)越多地采用其更周圍緊鄰環(huán)境的壽命值。
圖36：放大圖34數(shù)據(jù)的70 x 70像素區(qū)域，顯示大細(xì)胞的中心。不同的合并系數(shù)，從左到右的n= 0、1、2、4 和 6。在 bin ≤2（中心圖像），使用壽命對(duì)比度保持不變。它在 bin = 4 和bin = 6 時(shí)壽命對(duì)比度會(huì)降低，這可以從中心結(jié)構(gòu)顏色的褪色中看出。
圖像分割
與合并空間相關(guān)像素合并（binning）相比，圖像分割是組合了具有類似衰減特征的像素。
該過(guò)程如圖37左上所示，圖37顯示了SPCImage面板，其中包含低光子數(shù)的FLIM數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)與圖 34 上行中的數(shù)據(jù)相同，所選像素中的衰減數(shù)據(jù)顯示在面板的右下角。根據(jù)這些數(shù)據(jù)計(jì)算出的壽命圖像是嘈雜的，并且壽命的直方圖（右上）非常寬。下一步如圖 37（右上方）所示。相量圖（phasor plot）是根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算得出的，不出所料，相量分散在各處。
然而，壽命明顯不同的像素的相量（由顏色表示）出現(xiàn)在不同的相位/振幅位置。
在第三步中，選種一系列相量值，并在壽命圖像中突出顯示相應(yīng)的像素，請(qǐng)參見(jiàn)圖 37 左下角。可以移動(dòng)選擇區(qū)域，更改其大小和形狀以突出顯示圖像中的所需結(jié)構(gòu)。在所示的示例中，已選擇細(xì)胞的線粒體。即使選擇可能不完整，所選像素也都在圖像的所需結(jié)構(gòu)內(nèi)。
在最后一步，圖37，右下角，所選像素的衰減數(shù)據(jù)被組合成一條衰減曲線，這條曲線包含超過(guò)300萬(wàn)個(gè)光子。相比之下，圖34中單個(gè)像素中只有幾百個(gè)光子，在n=2的合并區(qū)域中大約有3000個(gè)光子。具有300萬(wàn)光子的衰減曲線可以進(jìn)行高精度分析，三指數(shù)分析很輕松，如圖 37 右下角所示，三指數(shù)衰減參數(shù)顯示在面板的右上方。
圖37：通過(guò)相量圖進(jìn)行圖像分割，并將所選像素組合成高光子數(shù)的單衰減曲線。
固定分量的壽命進(jìn)行分析
如果減少衰減參數(shù)的數(shù)量，多指數(shù)衰減分析將變得更加容易。因此，在數(shù)據(jù)分析中包括先驗(yàn)知識(shí)可以減少結(jié)果中的噪聲。圖38顯示了小鼠開(kāi)放性腫瘤的NADH圖像，用bh DCS-120 MACRO系統(tǒng)成像，有趣的參數(shù)是快速衰減分量的振幅a1。它代表游離NADH的比例，并指示組織相應(yīng)區(qū)域的新陳代謝類型。因此，使用雙指數(shù)模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并創(chuàng)建了a1圖像。使用所有參數(shù)（t1，t2，a1，a2）自由浮動(dòng)來(lái)分析左側(cè)的圖像，固定t2分析右側(cè)的圖像。不出所料，右側(cè)的圖像噪點(diǎn)較小，腫瘤在圖像和a1直方圖中都更清晰地突出。右側(cè)的直方圖甚至顯示兩個(gè)不同的像素群，一個(gè)為 a1 = 0.65，另一個(gè)為 a1 = 0.83，這些正是通常在健康組織和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的振幅。
圖38：小鼠腫瘤的NADH圖像顯示快速NADH成分的振幅a1。左：T1、t2、a1、a2浮動(dòng)。右：t2 固定為最常用值，2400 ps。下行：圖像像素上 a1 的直方圖。
在衰減分量的壽命預(yù)計(jì)恒定的情況下，使用固定參數(shù)進(jìn)行分析可以大大降低噪聲。但是，必須謹(jǐn)慎使用該技術(shù)，熒光壽命從來(lái)都不是絕對(duì)恒定的，分子環(huán)境總是有影響的。如果分量壽命是固定的，但不是絕對(duì)恒定的，則擬合過(guò)程會(huì)以其他參數(shù)的較大變化來(lái)響應(yīng)。因此，在固定分量壽命條件下，獲得的擬合結(jié)果可能具有較大的系統(tǒng)誤差。
最后一步：圖像強(qiáng)度和參數(shù)范圍
FLIM圖像應(yīng)清晰明了地展示相關(guān)論文中聲稱的科學(xué)事實(shí)，圖像不僅應(yīng)顯示正確的衰減參數(shù)，還應(yīng)將其顯示在適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度和衰減參數(shù)范圍內(nèi)。默認(rèn)情況下，SPCImage 使用強(qiáng)度自動(dòng)縮放，在正常情況下，自動(dòng)縮放會(huì)產(chǎn)生合理的圖像。但是，自動(dòng)縮放功能無(wú)法知道圖像的哪個(gè)部分是包含感興趣信息的部分。如果信息位于圖像的暗淡區(qū)域，則自動(dòng)縮放不一定能提供最佳圖像。此外，其他完美的圖像也可能包含一些過(guò)于明亮的點(diǎn)。在這些情況下，無(wú)論它們來(lái)自何處，自動(dòng)縮放都不會(huì)生成合理縮放的圖像，因此，應(yīng)關(guān)閉自動(dòng)縮放，并手動(dòng)調(diào)整強(qiáng)度刻度。圖39 顯示了一個(gè)示例，自動(dòng)縮放（左）會(huì)導(dǎo)致不良的縮放強(qiáng)度范圍，手動(dòng)調(diào)整強(qiáng)度范圍可生成正確平衡的圖像（右圖）。
具有不同參數(shù)比例的圖像的顯示如圖40和圖41所示，這些圖像顯示了分別以藍(lán)-綠-紅和紅-綠-藍(lán)兩色方向顯示的壽命圖像。參數(shù)范圍為 2000 到 3000 ps（左）和 2300 到 2700 ps（右）。哪種風(fēng)格最能體現(xiàn)感興趣的效果，必須根據(jù)具體情況來(lái)決定。
圖39：包含一些非常亮點(diǎn)的圖像。左：強(qiáng)度范圍的自動(dòng)縮放，自動(dòng)縮放功能可將強(qiáng)度縮放到最亮的特征，獲得的強(qiáng)度范圍不適合圖像的其余部分。右：手動(dòng)縮放可在正確的強(qiáng)度范圍內(nèi)生成圖像，單指數(shù)擬合的壽命，顏色范圍從2000 ps（藍(lán)色）到 3000 ps（紅色）。
圖40：圖39所示數(shù)據(jù)的不同表示形式，單指數(shù)壽命，手動(dòng)強(qiáng)度縮放。左：顏色方向 b-g-r，顏色范圍為 2000 至 3000 ps。右：顏色方向 b-g-r，顏色范圍為 2300 至 2700 ps。
圖 41：圖 39 中所示數(shù)據(jù)的不同表示形式，單指數(shù)壽命，手動(dòng)強(qiáng)度縮放。左：顏色方向 r-g-b，顏色范圍為 2000 至 3000 ps。右：顏色方向 r-g-b，顏色范圍為 2300 至 2700 ps。
總結(jié)
熒光壽命可以從TCSPC FLIM數(shù)據(jù)中得出，信噪比接近每像素光子數(shù)的平方根。因此，表征FLIM數(shù)據(jù)質(zhì)量的最重要參數(shù)是光子數(shù)。通過(guò)使用實(shí)際示例，我們已經(jīng)證明，通過(guò)簡(jiǎn)單地優(yōu)化探測(cè)效率和采集時(shí)間，可以獲得光子數(shù)為10倍。通過(guò)使用高效率的探測(cè)器，可以增加4倍，優(yōu)化的像素合并策略可以增加25倍。總而言之，這是光子數(shù)為1000倍、信噪比為32倍的提升。我們并不是說(shuō)在所有情況下都可以達(dá)到如此大的改進(jìn)，但幾乎在任何時(shí)候都可以實(shí)現(xiàn)相當(dāng)大的改進(jìn)。
FLIM系統(tǒng)的第二個(gè)重要參數(shù)是光子效率，光子效率描述了系統(tǒng)探測(cè)到的單個(gè)光子對(duì)結(jié)果的貢獻(xiàn)程度。換句話說(shuō)，它描述了系統(tǒng)與理想信噪比SQRT（N）的接近程度。雖然TCSPC系統(tǒng)接近理想，但光子效率通常可以通過(guò)使用正確的TCSPC定時(shí)參數(shù)，避免記錄背景信號(hào)以及使用足夠快IRF的探測(cè)器來(lái)優(yōu)化。通常，光子效率提高兩到四倍是可能的，只需遵守一些簡(jiǎn)單的信號(hào)記錄規(guī)則即可。
當(dāng)記錄和分析多指數(shù)衰減函數(shù)時(shí)，數(shù)據(jù)質(zhì)量變得尤為重要。在最常見(jiàn)的FLIM應(yīng)用中，多指數(shù)衰減是必須的。然后，信息主要在于衰減分量的振幅和壽命，而不是凈衰減函數(shù)的表觀壽命。這意味著不僅探測(cè)效率和光子效率很重要，儀器響應(yīng)函數(shù)IRF的寬度也很重要。此外，解析多指數(shù)衰減函數(shù)的選項(xiàng)在很大程度上取決于衰減函數(shù)的形狀，它們偏離單指數(shù)曲線的距離越大，就越能很好地分辨它們。因此，考慮好FLIM選項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)規(guī)劃和樣品優(yōu)化設(shè)計(jì)可以對(duì)研究的結(jié)果產(chǎn)生巨大影響。
最后，數(shù)據(jù)分析在任何FLIM實(shí)驗(yàn)中都起著重要作用，正確應(yīng)用的數(shù)據(jù)分析可以從記錄的數(shù)據(jù)中提取最大數(shù)量的信息。此外，它能夠以出版就緒的風(fēng)格呈現(xiàn)數(shù)據(jù)，令人信服地支持相關(guān)出版物中提出的科學(xué)主張。
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